在蛋白質純化過程中，需注意幾個問題。首先，提純過程中始終要控制pH值，盡量避免由于過酸或過堿而引起蛋白質構象的不可逆變化。緩沖液要有合適的pH值，又要對蛋白質無害，在提純植物和菌類中的蛋白質時，通常需要較大的緩沖容量，此時要注意緩沖液的濃度，同時還要注意緩沖液組分是否合適，會不會產生副反應等。含巰基的蛋白質（其中的巰基未結合成二硫鍵時）特別容易被氧化，因此，要維持一個還原環境。可加入一些含有巰基的還原劑，并使整個體系保持無氧狀態，以解決此問題，但在有些情況下，加入的巰基化合物可能會抑制蛋白質的活力。

提純過程中，通常要保持低溫，因為細胞內有蛋白水解酶存在，這種酶在組織勻化后處于活化狀態，能降解蛋白質。因此，必須保持低溫來降低水解酶的作用。但要注意，有時低溫又能使某些酶的四級結構遭到破壞。一般情況下，蛋白質在0℃時比較穩定，但丙酮素羧化酶對冷敏感，25℃時穩定。有些酶則需在-20℃或-70℃下穩定活性。

此外，還有一些常用的辦法可有效地減少蛋白質變性，如有些二價離子（Mg²⁺、Ca²⁺等）的存在有助于蛋白質或蛋白絡合物的穩定；提純酶時，可以加入專一性的底物；有時候需要使用絡合劑（如乙二胺四乙酸鹽）除去不需要的離子，特別是那些由水源帶來的有害金屬離子。這些方法可視不同情況加以利用。

要注意的另一個因素是，在提純過程中即使很小心，蛋白質也會發生結構上的變化。因此，提純后的蛋白質，即使其活力基本上得以保留，它的構象也可能不同于天然構象或完整功能的構象。在這種情況下，在生物體外測得的蛋白質的性質未必能準確地反映這些大分子在活體內的性狀。

含多個亞單位蛋白質的解離是一種特殊類型的變性。提純蛋白質時，當所測得的活力是僅由一種亞單位表現出來的時候，其他的亞單位可能會因為注意不到而丟失。有的蛋白質在體內具有多功能形式，其生物活性是由兩個以上不同的遺傳基因決定的蛋白質一起顯示出來的。那么由一個已經純化的蛋白質的性質去推斷它在體內完整的生物學功能時要特別小心。這時分析提純過程中總的活力是有益的。在提純的早期階段，如果用總活力作基準，在提純結束時希望能回收50%總活力，而實際所能達到的收率往往只有5%-20%。在有些情況下，特別是有大量原料可供利用的情況下，我們可專心致力于獲得高比活的樣品，而不必顧忌收率。